การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

อุปกรณ์ที่ใช้ในการทดลอง

อุปกรณ์ที่ใช้ในการทดลอง

ผลการทดลองโครงงานการเพาะเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย

เมื่อทดลองการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย  โดยการทดลองกับหม้อนึ่งความดันไอและหม้อนึ่งธรรมดา  ใช้อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ  สูตร  MS (Murashige  and  skoog, 1962) ในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จำนวน 20 ขวดระยะเวลา 2 สัปดาห์ พบว่ามีให้ผลการเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ ที่ออกมาใกล้เคียงกันดังตารางที่ 1 และ 2 ตามลำดับ

                       ตารางที่  1 ทดสอบเปรียบเทียบการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย  โดยทดลองกับหม้อนึ่งความดันไอและหม้อนึ่งธรรมดา ในสัปดาห์แรก

จากตารางที่ 1 พบว่า  ทดสอบเปรียบเทียบการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย  โดยทดลองกับหม้อนึ่งความดันไอและหม้อนึ่งธรรมดา ในสัปดาห์แรกนั้น ระยะเวลาในการอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ  สูตร  MS (Murashige  and  skoog, 1962) การเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ของหม้อนึ่งความดันไอจะเกิดเชื้อราในวันที่ 5 ของการทำการทดลองเป็นจำนวน 2 ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช และการเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ของหม้อนึ่งธรรมดาจะเกิดเชื้อราในวันที่ 3 ของการทำการทดลองเป็นจำนวน 1 ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

                        ตารางที่  2  ทดสอบเปรียบเทียบการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย  โดยทดลองกับหม้อนึ่งความดันไอและหม้อนึ่งธรรมดา  โดยใช้อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ในสัปดาห์ที่สอง

จากตารางที่  2 พบว่า  ทดสอบเปรียบเทียบการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย  โดยทดลองกับหม้อนึ่งความดันไอและหม้อนึ่งธรรมดา  โดยใช้อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ในสัปดาห์ที่สองนั้น ระยะเวลาในการอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ  สูตร  MS (Murashige  and  skoog, 1962) การเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์จะเกิดขึ้นและเห็นความชัดเจนมากกว่าสัปดาห์แรกที่ทำการทดลองซึ่งในสัปดาห์ที่สองนั้นการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ของหม้อนึ่งความดันไอจะเกิดเชื้อราในวันที่ 9,10 และ 13 ตามลำดับ ของการทำการทดลองเป็นจำนวน 5 ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชและการเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ของหม้อนึ่งธรรมดาจะเกิดเชื้อราในวันที่ 10 และ  13 ของการทำการทดลองเป็นจำนวน 3 ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

       หมายเหตุ   /        การเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์
                         -         ไม่การเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์
                         ( - )      จำนวนการเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ในขวดเพาะเลี้ยง

การทดลองการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย

1.ชั่งสารเตรียม Stock 

2.ใช้ปิเปตดูดสารและเติมน้ำตาลทราย

3.ปรับปริมาตร และปรับ pH  (5.6 -5.8)

4.เคี่ยวหลอมวุ้นให้ละลาย

5.เติมฮอร์โมนตามสูตร ms แล้วบรรจุอาหารลงในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

6.นำขวดอาหารลงหม้อนึ่งความดันไอ

7.นึ่งฆ่าเชื้อที่ความดัน  15  ปอนด์/ตารางนิ้ว อุณหภูมิ  121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา  15  นาที  

เทคโนโลยีชีวภาพ แหล่งรวมความรู้ทางเทคโนโลยีชีวภาพ

การใช้ประโยชน์จาก การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช (Applications of Plant Tissue Culture)

การใช้ประโยชน์จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

- ทำให้สามารถเพิ่มจำนวนต้นพันธุ์พืชที่ต้องการในปริมาณอันมากในเวลาอันรวดเร็วได้
- ทำให้สามารถผลิตต้นพืชที่มีลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนต้นที่เป็นต้นแบบได้
- ทำให้สามารถผลิตต้นพืชจำนวนหลายๆต้นที่มีขนาดสม่ำเสมอกันได้

- ทำให้สามารถผลิตต้นพืชที่ปราศจากโรคได้
- ทำให้สามารถเก็บรักษาพันธุ์พืชพื้นเมืองที่มีอยู่เดิม พันธุ์พืชหายาก พันธุ์พืชที่ใกล้สูญพันธุ์ พันธุ์พืชที่มีลักษณะที่ดี พันธุ์พืชที่มีลักษณะที่ต้องการ หรือพันธุ์พืชที่แลกเปลี่ยนระหว่างประเทศได้
- ทำให้สามารถใช้ปรับปรุงพันธุ์พืชได้
- ทำให้สามารถผลิตยาหรือสารเคมีที่ได้จากพืชได้
- สามารถใช้ประโยชน์เพื่อการสกัดสารจากต้นพืชเพื่อนำมาใช้ประโยชน์ในด้านต่างๆได้
- ทำให้สามารถผลิตพันธุ์พืชที่มีความต้านทานหรือทนทานได้ เช่น พันธุ์พืชที่ทนต่อดินเค็ม หรือ ดินเปรี้ยว, พันธุ์พืชที่ทนต่อสภาพอากาศร้อนหรือหนาว, พันธุ์พืชที่ทนต่อสารเคมีกำจัดศัตรูพืช, พันธุ์พืชที่ทนต่อโรคต่างๆและสารพิษต่างๆที่เกิดจากพวก เชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส
- ทำให้สามารถผลิตโปรโตพลาสหรือโพรโทพลาส(protoplasts)ได้
- ทำให้สามารถผลิตพืชที่มีโครโมโซม(chromosome)หลายชุด(polyploids)ได้

การเพราะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชคือ การนำเอาเนื้อเยื่อ หรือเซลล์ หรืออวัยวะที่ยังอ่อนของพืชมาเลี้ยงในสภาวะปลอดเชื้อ รวมถึงมีการให้อาหารสังเคราะห์ที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโต และมีการควบคุมสภาพแวดล้อม ได้แก่ แสง อุณหภูมิ ความชื้น ให้พอเหมาะ ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ภายในห้องปฏิบัติการต้องมีการทำความสะอาดเป็นอย่างดีและสม่ำเสมอ ผู้ปฏิบัติงานต้องมีการรักษาความสะอาดของร่างกายและเสื้อผ้าเป็นอย่างดี วัสดุอุปกรณ์เครื่องมือต่างๆ รวมถึงเนื้อเยื่อพืชควรผ่านการฆ่าเชื้อ เช่น เครื่องแก้วควรผ่านการอบที่อุณหภูมิ 180 องศาเซลเซียส นาน 3 ชั่วโมง อาหารสังเคราะห์ควรผ่านการนึ่งที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลาอย่างน้อย 15 – 20 นาที เนื้อเยื่อควรกำจัดเอาสิ่งสกปรกออกก่อนแล้วจึงฆ่าเชื้อที่อยู่ตามผิวด้วยสารเคมี เช่น เช็ดด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ ปากคีบและใบมีดอาจฆ่าเชื้อโดย การจุ่มในเอทิลแอลกอฮอล์ 95% แล้วเผาไฟ นอกจากการทำความสะอาดเพื่อให้ภายในห้องปฏิบัติการปลอดเชื้อแล้ว ยังต้องมีการควบคุม สภาพแวดล้อมอื่นๆ ภายในห้องเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่ออีกด้วย เช่น ความเข้มของแสงจะถูกควบคุมให้อยู่ที่ประมาณ 1000 – 2000 ลักซ์ อุณหภูมิจะถูกปรับให้อยู่ที่ประมาณ 25 องศาเซลเซียส ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่พืชทั่วๆ ไปเจริญได้ดี ส่วนประกอบของอาหารสังเคราะห์โดยทั่วไปมีดังนี้ - แร่ธาตุ เช่น ไนโตรเจน ฟอสฟอรัส โพแทสเซียม - คาร์โบไฮเดรต ซูโครส (sucrose) นิยมใช้เป็นส่วนใหญ่ - วิตามิน เช่น ไทอามีน (thiamine) นิโคทินิกแอซิด (nicotinic acid) - กรดอะมิโน - กรดอินทรีย์ เช่น ซิเทรต (citrate) มาเลต (malate) - สารประกอบจากธรรมชาติ เช่น น้ำมะพร้าว - สารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช ออกซิน (auxin) และไซโทไคนิน (cytokinin) นิยมนำมาใช้ - สารที่ช่วยให้อาหารแข็งตัวและวัสดุช่วยพยุงเนื้อเยื่อพืช วุ้น (agar) และเจลาตินโดยทั่วไปมักใช้ใส่ลงไป ในอาหารเพื่อทำให้อาหารแข็งตัว ส่วนกระดาษกรอง สำลี หรือใยสังเคราะห์เป็นวัสดุช่วยพยุงเนื้อเยื่อเมื่อเลี้ยงในอาหารเหลว แหล่งข้อมูล พัชรา ลิมปนะเวช. (2553). การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. ในสารานุกรมไทยสำหรับเยาวชน โดยพระราชประสงค์ ในพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว. (เล่มที่ 31, หน้า 128-159). กรุงเทพฯ : โครงการสารานุกรมไทยสำหรับเยาวชน โดยพระราชประสงค์ในพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว.

เทคนิคการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

                                                       

         การเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คือการนำเอาส่วนใดของพืช ไม่ว่าจะเป็นอวัยวะ (Organ) เนื้อเยื่อ (tissue) เซลล์ (cell) หรือเซลล์ที่ไม่มีผนังเซลล์ที่เรียกว่าโพรโตพลาสต์ (protoplast) ของพืช มาเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ (synthetic media) ซึ่งประกอบด้วยเกลือ แร่ธาตุ น้ำตาล วิตามิน และฮอร์โมนพืชในสภาพปลอดเชื้อ (aseptic condition) จากเชื้อราและแบคทีเรีย และในสภาพแวดล้อมที่ควบคุม เช่น อุณหภูมิ ความชื้น และแสงสว่าง

ชิ้นส่วนของพืชที่เพาะเลี้ยงจะเจริญได้ 3 รูปแบบ แล้วแต่ว่าจะนำชิ้นส่วนนั้นมาจากไหน
1. เจริญเป็นต้นที่มีรากหรือบางทีก็มีดอก เรียกว่าเกิด organogenesis
2. เจริญเป็นแคลลัส (callus) ซึ่งเป็นกลุ่มของเซลล์ ส่วนใหญ่จะเป็น parenchyma cell ที่ยังไม่เปลี่ยนแปลงไปเป็นต้นหรือรากแต่ก็สามารถเป็นต้นได้
3. เจริญไปเป็น embryoid ซึ่งมีลักษณะเหมือน embryo ที่ได้จาก zygote แต่ embryoid ได้มาจาก somatic cell จะเจริญเติบโตเป็นต้นที่มีรากต่อไป

เทคนิคการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช  มี 5 ขั้นตอน
                                                        
1. การเตรียมอาหารสำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช2. การฟอกฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืช3. การนำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชลงขวด4. การนำขวดเนื้อเยื่อพืชไปเลี้ยง
5. การย้ายเอาพืชออกจากขวดปลูกลงดิน

1.  การเตรียมอาหารสำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
           อาหารที่ใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อ ต้องสะอาดและมีแร่ธาตุอาหารครบตามที่พืชชนิดนั้นต้องการและเหมาะสม อาหารสูตร MS เป็นสูตรอาหารที่มีผู้ใช้กันมาก และพบว่าในสารอาหารทั้งธาตุอนินทรีย์หลัก เช่น ไนโตรเจน ฟอสฟอรัสและโพแทสเซียม (NPK) และธาตุอาหารรองอื่น ๆ รวมทั้งสารประกอบของกรดอะมิโน วิตามิน ฮอร์โมน และน้ำตาลต้องอยู่ในสภาพปลอดเชื้อ

การเตรียมอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสูตร MS (Murashige and Skoog)
อุปกรณ์
1. เครื่องชั่งไฟฟ้าอย่างละเอียด
2. เครื่องวัดความเป็นกรด – ด่าง (pH meter)
3. หม้อนึ่งอัดไอ (autoclave)
4. เตาไฟฟ้า (hot plate)
5. ปิเปตขนาดต่าง ๆ
6. บีกเกอร์
7. กระบอกตวง
8. ขวดรูปชมพู่
9. หลอดหยด
10. กรวยแก้ว
11. ขวดใส่ stock solution และอาหาร
12. อะลูมิเนียมฟอยด์ หรือจุกยางหรือสำลี
สารเคมี
1. สารเคมีในสูตรของอาหารใน Stock ต่าง ๆ
2. สารเคมีสำหรับปรับค่า ph ของอาหารคือ Potassium hydroxide (KOH) หรือ Sodium hydroxide (NaOH) และ Hydrochloric acid (HCI)
3. น้ำกลั่น
วิธีทำ
ก.  ทำการเตรียม stock solution ต่าง ๆ ตามสูตรของ Murashige and Skoog โดยเตรียมอัตราส่วนดังนี้
1.  ธาตุอาหารทางอนินทรีย์ (inorganic salt) เตรียมสารละลายเข้มข้น 100 เท่า ของความเข้มข้นในอาหาร
1.1  Stock 1
  NH4NO3       165 g
  KNO3        190  g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

1.2   Stock 2
  MgSO4.7H2O          37  g
  MnSO4.H2O    1,690  g
  ZnSO4.7H2O    0.860 g
  CuSO4.5H2O    0.0025 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

1.3   Stock 3
  CaCl2.2H2O         44 g
  Kl     0.083 g
  CaCl2.6H2O    0.0025 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000  ml

1.4   Stock 4
  KH2PO4     17 g
  H3BO3     0.620 g
  Na2MOO4.2H2O    0.025 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

1.5   Stock 5
  FeSO4.7 H2O    2.784 g
  Na2EDTA    3.724 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml
2.  สารประกอบของสารอินทรีย์ (organic compounds)

2.1   Stock 6   ความเข้มข้น 200 เท่าของความเข้มข้นในอาหาร
  Inositol     2.0 g
  Nicotinic acid    0.01 g
  Pyridoxine HCI    0.01 g
  Thiamin HCI    0.002 g
  glycine     0.04 g
  ผสมรวมกันแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

2.2    สารประกอบกระตุ้นฮอร์โมน (hormonal substanus) ความเข้มข้น 100 ppm.
* ฮอร์โมนเร่งราก stock NAA
(naptthalene acetic acid)  0.01 g
นำมาผสมน้ำให้ครบ   100 ml
* ฮอร์โมนเร่งยอด stock BA
(6 – Benzyladenine)   0.01 g
นำมาผสมน้ำให้ครบ   100 ml

ข.  ทำการตวงสารละลายที่เตรียมในข้อ ก. ด้วยปิเปตในอัตราของการเตรียมอาหาร 100 ml
  Stock  1     1 ml
  Stock  2     1 ml
  Stock  3     1 ml
  Stock  4     1 ml
  Stock  5     1 ml
  Stock  6     0.5 ml
  ชั่งน้ำตาล sucrose   3 g
  ฮอร์โมนเร่งราก stock NAA  1 ml
  ฮอร์โมนเร่งยอด stock BA  1 ml

           นำทั้งหมดมารวมกันแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ 50 ml (ควรปรับค่า pH ให้เท่ากับ 5.6 โดยใช้ KOH และ HCI ในการปรับค่า pH) จากนั้นเติมน้ำกลั่นให้ครบ 100 ml ถ้าหากทำเป็นอาหารแข็งให้เติมวุ้น (agar) ลงไปในปริมาณ 0.8 g โดยหลอมให้ละลายก่อน

ค.  จากนั้นเทใส่ขวดอาหารปริมาณ 1 ใน 5 ของขวดอาหาร หรือ 1 ใน 4 ของขวดอาหาร ปิดฝาขวด แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เวลานาน 15 นาที ทิ้งไว้จนอุ่นแล้วจึงปิดฝาให้สนิท ทิ้งให้เย็น เก็บเข้าชั้นเพื่อใช้ต่อไป
*สูตรอาหารดัดแปลง Vacin & Went เหมาะสำหรับการเลี้ยงเนื้อเยื่อของกล้วยไม้โดยเฉพาะ ถ้าจะให้สะดวกควรเตรียม Stock Solution ดังนี้
Stock Solution  A  (100 X)
 potassium nitrate   50.5 g
 monopotassium acid phosphate  20.5 g
 ammonium sulphate   50.0 g
 manganese sulphate   0.68 g
 ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml
Stock Solution  B  (100 X)
 magnesium sulphate   25.0 g
 เติมน้ำกลั่นให้ครบ   1,000 ml
Stock Solution  C  (200 X)
 sodium EDTA    7.45 g
 ferrous sulphate    5.75 g
 ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml
มีวิธีการเตรียมเป็นขั้นตอนดังนี้
 1. ใช้ Stock Solution  A     10   ml
         Stock Solution  B     10   ml
         Stock Solution  C       5   ml
 2.  ใส่ Tricalcium phosphate 0.20 g ที่ละลาย ด้วยกรดเกลือความเข้มข้น 1 normal แล้ว
 3.  เติมน้ำมะพร้าว   150   ml
 4.  เติมน้ำตาล   20   g
 5.  เติมน้ำให้ครบ   1,000   ml
 6.  ปรับ pH ให้ได้   4.8 – 5
 7.  เติมวุ้น   8   g   (ถ้าต้องการอาหารเหลวก็ไม่ต้องเติมวุ้น)
 8.  ต้มวุ้นจนละลายหมด
 9.  เทลงในขวดแก้วปิดจุก
 10. นึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งอัดไอที่อุณหภูมิ 121°C  นาน 15 นาที
 11. ทิ้งไว้ให้เย็นจนวุ้นแข็งจึงนำไปใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อได้

2.  การฟอกฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืช
                                                     
 วิธีการฟอกฆ่าเชื้ออาจดัดแปลงจากวิธีการนี้ เพื่อให้เหมาะสมกับชิ้นส่วนของพืชที่จะนำมาเลี้ยง แต่ส่วนใหญ่จะมีขั้นตอนดังนี้
1.  ควรเลือกชิ้นส่วนของพืชที่จะนำมาเลี้ยงให้ปราศจากโรคและเป็นส่วนที่ยังอ่อนอยู่ ตายอดและข้อเป็นอวัยวะที่ดีที่สุด แต่ส่วนอื่น ๆ เช่น ใบ ดอก ราก ก็ใช้ได้ ที่สำคัญจะต้องไม่แก่หรืออ่อนเกินไป
 2.  ตัดเฉพาะชิ้นส่วนที่ต้องการนำมาล้างให้สะอาดด้วยผงซักฟอก
 3.  ชุบในเอทิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 – 2 นาที
 4.  แช่ต่อด้วยน้ำยาคลอร็อกซ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 – 15 นาที
 5.  แช่ต่อด้วยน้ำยาคลอร็อกซ์ 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 นาที
 6.  นำไปล้างน้ำที่นึ่งฆ่าเชื้อโรคแล้ว ประมาณ 3 ครั้ง นำเข้าตู้ปลอดเชื้อ หรือตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ เพื่อเตรียมตัดชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชลงในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อต่อไป
           การเตรียมน้ำยาฟอกฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในเนื้อเยื่อพืช น้ำยาฟอกฆ่าเชื้อนี้จะทำการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ได้เฉพาะที่ติดอยู่ที่ผิวเท่านั้น เรียกว่าทำ Surface sterilization ส่วนเชื้อจุลินทรีย์ที่อยู่ภายในเนื้อเยื่อพืช ทำให้เกิดโรคพืชนั้นยากแก่การฟอกฆ่าเชื้อ
           1.  เอทิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์ เตรียมได้จากการใช้ เอทิลแอลกอฮอล์ 95 เปอร์เซ็นต์ จำนวน 70 ml  เติมน้ำ   25  ml
          2.  คลอร็อกซ์ 10 เปอร์เซ็นต์ ได้จากการใช้น้ำ 90 ml  นึ่งในหม้อนึ่งอัดไอฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ไว้ก่อนแล้ว เมื่อจะใช้ก็เติมคลอร็อกซ์ 10 ml และสารลดแรงตึงผิว (wetting agent) เช่น Tween-20  1 – 2 หยด
           3.  คลอร็อกซ์ 5 เปอร์เซ็นต์ ได้จากการใช้น้ำ 95 ml  นึ่งในหม้อนึ่งอัดไอฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ไว้ก่อนแล้ว เมื่อจะใช้ก็เติมคลอร็อกซ์ 5 ml และสารลดแรงตึงผิว  1 – 2 หยด
           4.  น้ำ 100 มิลลิลิตร นึ่งฆ่าเชื้อไว้สำหรับล้างเอาคลอร็อกซ์ออกจากชิ้นส่วนพืชก่อนนำไปเลี้ยงบนอาหาร

3.  การนำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชลงขวด   
ขั้นตอน            1.  เตรียมทำความสะอาดตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ โดยการใช้เอทิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์ ฉีดพ่นให้ทั่วบริเวณตู้ แล้วใช้ผ้าสะอาดที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้วเช็ดให้สะอาดทั่วบริเวณ ทิ้งไว้สัก 10 นาที ก่อนใช้งาน
            2.  เตรียมเช็ดขวดอาหารที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว วางเรียงในตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ และชิ้นส่วนเนื้อเยื่อที่ฟอกฆ่าเชื้อแล้ว
            3.  ใช้ปากคีบ มีดผ่าตัดที่สะอาดโดยชุบเอทิลแอลกอฮอล์ 95 เปอร์เซ็นต์ ลนไฟ ทิ้งไว้ให้เย็น โดยวางบนจานแก้วที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว
            4.  ลนไฟบริเวณปากขวดอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อก่อนเปิดฝา
            5.  นำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อวางบนจานแก้ว ตัดชิ้นส่วนให้เล็กพอเหมาะ แล้วคีบใส่ขวดอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยอาจจะวางหรือแทงลงไปบนอาหารเล็กน้อย ลนไฟบริเวณปากขวดอีกครั้ง แล้วรีบปิดฝาขวดทันที

4.  การนำขวดเนื้อเยื่อพืชไปเลี้ยง   
                                                     
ขั้นตอน           1.  นำขวดที่จะเลี้ยงเนื้อเยื่อไปวางบนชั้นในห้องเลี้ยงเนื้อเยื่ออุณหภูมิ 25 - 28°C ความเข้มของแสง 1,000 – 2,000 ลักซ์ (หลอดไฟ 40 วัตต์ จำนวน 2 หลอด) ช่วงแสง 16 ชั่วโมงต่อวัน และช่วงมืด 8 ชั่วโมงต่อวัน
           2.  ติดตามสังเกตการณ์เจริญเติบโตของชิ้นส่วนพืช ในระยะ 3 -7 วัน สังเกตว่าชิ้นส่วนนั้นมีเชื้อราหรือแบคทีเรียขึ้นหรือไม่ ถ้ามีให้รีบนำออกจากห้องไป ถ้าขวดไหนไม่มีก็เลี้ยงต่อไป สังเกตและเปลี่ยนอาหารใหม่ทุก 2 – 4 สัปดาห์ จนได้ต้นพืชที่สมบูรณ์

5.  การย้ายเอาพืชออกจากขวดปลูกลงดิน            1.  ใช้ปากคีบหรือลวดปลายงอ ค่อย ๆ ดึงเอาต้นพืชที่แข็งแรงที่มีรากที่สมบูรณ์ออกจากขวดระวังอย่าให้ต้นช้ำ
            2.  นำไปล้างเอาวุ้นออกให้หมดด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำประปา
            3.  นำต้นพืชมาแช่ในยากันรา  นำไปปลูกในถาดเพาะชำ หรือกระถางที่มีทรายผสมขุยมะพร้าวในอัตราส่วน 1 : 1 (เก็บไว้ในที่ร่ม อย่าให้ถูกแสงโดยตรง เพราะจะทำให้ต้นสูญเสียน้ำไป ทำให้ต้นเหี่ยว)
            4.  เมื่อต้นพืชตั้งตัวแข็งแรงดีแล้ว ก็ย้ายลงปลูกในดินต่อไปสำหรับต้นกล้วยไม้ นำไปปลูกในกระถางขนาดเล็ก ใส่ถ่านและออสมันด้า เมื่อต้นมีขนาดโตแล้ว ย้ายลงกระถางขนาดใหญ่