การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (ตอนที่ 2)

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (ตอนที่ 2)

โครงการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ฝ่ายวิชาการ สถาบันการแพทย์แผนไทย

การเตรียมอาหารเพื่อขยายพันธุ์และการเตรียม Stock Solution   "อาหารเพื่อการขยายพันธุ์"  คือ อาหารสังเคราะห์ที่เกิดจากการนำธาตุอาหารสังเคราะห์ต่างๆ มารวมกันปรับค่า pH ให้ได้ตามสูตรที่ต้องการ และเพิ่มความแข็งเพื่อการเกาะยึดด้วยวุ้น แล้วนำไปฆ่าเชื้อให้อาหารอยู่ในสภาพปลอดเชื้อ ส่วน Stock Solution คือการเตรียมสารเคมีตามสูตรในปริมาณที่เข้มข้น เพื่อความสะดวกในการนำไปใช้ Stock Solution สูตรอาหาร Murashige and Skoog.1962 (MS) สูตรเข้มข้น ปริมาณสารที่ดูดใช้ Stock 1 ความเข้มข้น 50 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml โปตัสเซียมไนเตรท (KNO3) อัมโมเนียมไนเตรท (NH2NO3) แคลเซียมคลอไรด์ (CACL2) 95.00 g 82.50 g 22.00 g 20 ml / L Stock 2 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml โปตัสเซียมไอโอไดร์ (KL) โซเดียมโมลิเดท (NA2MOO42H2O) โคบอลคลอไรด์ (C0CL26H2O)                8.30 g 2.50 g 0.25 g 0.1 ml / L Stock 3 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml มายโออินโนซิตอล (MTO-INOSITOL) บอริกแอซิค (H3BO3) โปตัสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) แมกนีเซียมซัลเฟต (MGSO47H2O) แมงกานีสซัลเฟต (MNSO4H2O) ซิงค์ซัลเฟต (ZNSO47H2O) 10.00 g 0.62 g 17.0 g 37.00 g. 2.23 g 0.86 g 10 ml/ L Stock 4 ความเข้มข้น 200 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml เอทธิลีนไดเอมีนเตตราอาซิเตต (EDTA) เฟอรัสซัลเฟต (FESO47H2O) 7.45 g 5.57 g 5 ml / L Stock 5 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml ไกลซีน (GLYCINE) นิโคตินิคแอซิด (NICOTINIC ACID) ไทอามีนไฮโดรคลอริค แอซิด (THIAMIN HCL) ไพรีดอกซีนไฮโดรคลอริค แอซิด (PYRIDOXINE.HCL) 0.20 g 0.05 g 0.01 g 0.05 g 10 ml / L Stock 6 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml คอปเปอร์ซัลเฟท (CUSO45H2O) 0.25 g 0.1 ml / L (ทำละลายใน HCL 1N)      การเตรียม Stock Solution นี้ เมื่อเตรียมเสร้จแล้วควรใส่ขวดสีชาและเก็บไว้ในที่เย็นเพื่อยืดอายุการใช้งาน การเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสูตร murashige and skoog.1926 (ms)      1. ตวงนำกลั่นใส่ภาชนะ 200 ทส      2. ตวง Stock solution 1-6 แต่ละตัวตามปริมาตรที่กำหนดใส่ภาชนะที่มีน้ำกลั่นอยู่      3. เติมน้ำตาลซูโคส 30 g      4. ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1,000 ml      5. ปรับต่อ PH ด้วย HCl 1 N หรือ NaOH 1 N ให้อยู่ในช่วง 5.6-5.8      6. ชั่งวุ้น 7 g นำไปเคี่ยวหลอมวุ้นจนเข้ากันดี      7. นำไปเทใส่ขวดขนาด 5 ออนซ์ 20 ml ขนาด 8 ออด์ 30 ml ปิดฝา      8. นำไปฆ่าเชื่อโดยใช้หม้อนึ่งความดันไอน้ำอุณหภูมิ 121 ํC เป็นเวลา 15 นาที (นับที่อุณหภูมิ 121 ํC ) ยกออกจากหม้อ ทิ้งไว้ให้เย็น ก่อนนำไปใช้ (ควรทิ้งไว้ 1 คืนก่อนนำไปใช้)      เมื่อทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อขึ้นเป็นต้นกล้าสูงพอประมาณถึงคอขวด ให้ทำการเพิ่มปริมาณต้น วิธีการปฏิบัติ      1. คัดเลือกพืชในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่สามารถนำมาเพิ่มปริมาณได้      2. ทำการแบ่งเนื้อเยื่อในขวดภายใต้สภาพปลอดเชื้อ (ทำในตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ)      3. การแบ่งเนื้อเยื่อมห้ตัดแต่งส่วนที่ไม่มีชีวิต ใบและรากบางส่วนทิ้งไป      4. ตัดแบ่งเนื้อเยื่อเป็นส่วน ๆ โดยต้นพืชในขวดที่มีการเพิ่มจำนวนด้วยการแตกหน่อ ให้ตัดแบ่งหน่อเป็นกอ ๆ ละ 2-3 ต้น      5. ต้นพืชที่มีการเจริญเป็นต้นเดี่ยว ให้ตัดแบ่งเป็นข้อ ๆ โดยแต่ละข้อให้มีตาติดอยู่      6. นำเนื้อเยื่อที่ได้ตัดแบ่งไว้วางลงบนอาหารใหม่ นำไปวางบนชั้นเลี้ยงต่อไป เมื่อต้นโตได้ขนาดแล้ว ถ้าจะทำการเพิ่มปริมาณต้นให้ทำเหมือนเดิม แต่ถ้าจะนำไปปลูก ให้นำต้นพืชนั้นไปชักนำให้เกิดราก และย้ายออกปลูกในภายหลัง  ที่มา : http://ittm.dtam.moph.go.th/data_all/articles/article28.htm