เทคนิคการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

                                                       

         การเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คือการนำเอาส่วนใดของพืช ไม่ว่าจะเป็นอวัยวะ (Organ) เนื้อเยื่อ (tissue) เซลล์ (cell) หรือเซลล์ที่ไม่มีผนังเซลล์ที่เรียกว่าโพรโตพลาสต์ (protoplast) ของพืช มาเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ (synthetic media) ซึ่งประกอบด้วยเกลือ แร่ธาตุ น้ำตาล วิตามิน และฮอร์โมนพืชในสภาพปลอดเชื้อ (aseptic condition) จากเชื้อราและแบคทีเรีย และในสภาพแวดล้อมที่ควบคุม เช่น อุณหภูมิ ความชื้น และแสงสว่าง

ชิ้นส่วนของพืชที่เพาะเลี้ยงจะเจริญได้ 3 รูปแบบ แล้วแต่ว่าจะนำชิ้นส่วนนั้นมาจากไหน
1. เจริญเป็นต้นที่มีรากหรือบางทีก็มีดอก เรียกว่าเกิด organogenesis
2. เจริญเป็นแคลลัส (callus) ซึ่งเป็นกลุ่มของเซลล์ ส่วนใหญ่จะเป็น parenchyma cell ที่ยังไม่เปลี่ยนแปลงไปเป็นต้นหรือรากแต่ก็สามารถเป็นต้นได้
3. เจริญไปเป็น embryoid ซึ่งมีลักษณะเหมือน embryo ที่ได้จาก zygote แต่ embryoid ได้มาจาก somatic cell จะเจริญเติบโตเป็นต้นที่มีรากต่อไป

เทคนิคการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช  มี 5 ขั้นตอน
                                                        
1. การเตรียมอาหารสำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช2. การฟอกฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืช3. การนำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชลงขวด4. การนำขวดเนื้อเยื่อพืชไปเลี้ยง
5. การย้ายเอาพืชออกจากขวดปลูกลงดิน

1.  การเตรียมอาหารสำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
           อาหารที่ใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อ ต้องสะอาดและมีแร่ธาตุอาหารครบตามที่พืชชนิดนั้นต้องการและเหมาะสม อาหารสูตร MS เป็นสูตรอาหารที่มีผู้ใช้กันมาก และพบว่าในสารอาหารทั้งธาตุอนินทรีย์หลัก เช่น ไนโตรเจน ฟอสฟอรัสและโพแทสเซียม (NPK) และธาตุอาหารรองอื่น ๆ รวมทั้งสารประกอบของกรดอะมิโน วิตามิน ฮอร์โมน และน้ำตาลต้องอยู่ในสภาพปลอดเชื้อ

การเตรียมอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสูตร MS (Murashige and Skoog)
อุปกรณ์
1. เครื่องชั่งไฟฟ้าอย่างละเอียด
2. เครื่องวัดความเป็นกรด – ด่าง (pH meter)
3. หม้อนึ่งอัดไอ (autoclave)
4. เตาไฟฟ้า (hot plate)
5. ปิเปตขนาดต่าง ๆ
6. บีกเกอร์
7. กระบอกตวง
8. ขวดรูปชมพู่
9. หลอดหยด
10. กรวยแก้ว
11. ขวดใส่ stock solution และอาหาร
12. อะลูมิเนียมฟอยด์ หรือจุกยางหรือสำลี
สารเคมี
1. สารเคมีในสูตรของอาหารใน Stock ต่าง ๆ
2. สารเคมีสำหรับปรับค่า ph ของอาหารคือ Potassium hydroxide (KOH) หรือ Sodium hydroxide (NaOH) และ Hydrochloric acid (HCI)
3. น้ำกลั่น
วิธีทำ
ก.  ทำการเตรียม stock solution ต่าง ๆ ตามสูตรของ Murashige and Skoog โดยเตรียมอัตราส่วนดังนี้
1.  ธาตุอาหารทางอนินทรีย์ (inorganic salt) เตรียมสารละลายเข้มข้น 100 เท่า ของความเข้มข้นในอาหาร
1.1  Stock 1
  NH4NO3       165 g
  KNO3        190  g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

1.2   Stock 2
  MgSO4.7H2O          37  g
  MnSO4.H2O    1,690  g
  ZnSO4.7H2O    0.860 g
  CuSO4.5H2O    0.0025 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

1.3   Stock 3
  CaCl2.2H2O         44 g
  Kl     0.083 g
  CaCl2.6H2O    0.0025 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000  ml

1.4   Stock 4
  KH2PO4     17 g
  H3BO3     0.620 g
  Na2MOO4.2H2O    0.025 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

1.5   Stock 5
  FeSO4.7 H2O    2.784 g
  Na2EDTA    3.724 g
  ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml
2.  สารประกอบของสารอินทรีย์ (organic compounds)

2.1   Stock 6   ความเข้มข้น 200 เท่าของความเข้มข้นในอาหาร
  Inositol     2.0 g
  Nicotinic acid    0.01 g
  Pyridoxine HCI    0.01 g
  Thiamin HCI    0.002 g
  glycine     0.04 g
  ผสมรวมกันแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml

2.2    สารประกอบกระตุ้นฮอร์โมน (hormonal substanus) ความเข้มข้น 100 ppm.
* ฮอร์โมนเร่งราก stock NAA
(naptthalene acetic acid)  0.01 g
นำมาผสมน้ำให้ครบ   100 ml
* ฮอร์โมนเร่งยอด stock BA
(6 – Benzyladenine)   0.01 g
นำมาผสมน้ำให้ครบ   100 ml

ข.  ทำการตวงสารละลายที่เตรียมในข้อ ก. ด้วยปิเปตในอัตราของการเตรียมอาหาร 100 ml
  Stock  1     1 ml
  Stock  2     1 ml
  Stock  3     1 ml
  Stock  4     1 ml
  Stock  5     1 ml
  Stock  6     0.5 ml
  ชั่งน้ำตาล sucrose   3 g
  ฮอร์โมนเร่งราก stock NAA  1 ml
  ฮอร์โมนเร่งยอด stock BA  1 ml

           นำทั้งหมดมารวมกันแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ 50 ml (ควรปรับค่า pH ให้เท่ากับ 5.6 โดยใช้ KOH และ HCI ในการปรับค่า pH) จากนั้นเติมน้ำกลั่นให้ครบ 100 ml ถ้าหากทำเป็นอาหารแข็งให้เติมวุ้น (agar) ลงไปในปริมาณ 0.8 g โดยหลอมให้ละลายก่อน

ค.  จากนั้นเทใส่ขวดอาหารปริมาณ 1 ใน 5 ของขวดอาหาร หรือ 1 ใน 4 ของขวดอาหาร ปิดฝาขวด แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เวลานาน 15 นาที ทิ้งไว้จนอุ่นแล้วจึงปิดฝาให้สนิท ทิ้งให้เย็น เก็บเข้าชั้นเพื่อใช้ต่อไป
*สูตรอาหารดัดแปลง Vacin & Went เหมาะสำหรับการเลี้ยงเนื้อเยื่อของกล้วยไม้โดยเฉพาะ ถ้าจะให้สะดวกควรเตรียม Stock Solution ดังนี้
Stock Solution  A  (100 X)
 potassium nitrate   50.5 g
 monopotassium acid phosphate  20.5 g
 ammonium sulphate   50.0 g
 manganese sulphate   0.68 g
 ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml
Stock Solution  B  (100 X)
 magnesium sulphate   25.0 g
 เติมน้ำกลั่นให้ครบ   1,000 ml
Stock Solution  C  (200 X)
 sodium EDTA    7.45 g
 ferrous sulphate    5.75 g
 ผสมแล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ  1,000 ml
มีวิธีการเตรียมเป็นขั้นตอนดังนี้
 1. ใช้ Stock Solution  A     10   ml
         Stock Solution  B     10   ml
         Stock Solution  C       5   ml
 2.  ใส่ Tricalcium phosphate 0.20 g ที่ละลาย ด้วยกรดเกลือความเข้มข้น 1 normal แล้ว
 3.  เติมน้ำมะพร้าว   150   ml
 4.  เติมน้ำตาล   20   g
 5.  เติมน้ำให้ครบ   1,000   ml
 6.  ปรับ pH ให้ได้   4.8 – 5
 7.  เติมวุ้น   8   g   (ถ้าต้องการอาหารเหลวก็ไม่ต้องเติมวุ้น)
 8.  ต้มวุ้นจนละลายหมด
 9.  เทลงในขวดแก้วปิดจุก
 10. นึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งอัดไอที่อุณหภูมิ 121°C  นาน 15 นาที
 11. ทิ้งไว้ให้เย็นจนวุ้นแข็งจึงนำไปใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อได้

2.  การฟอกฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืช
                                                     
 วิธีการฟอกฆ่าเชื้ออาจดัดแปลงจากวิธีการนี้ เพื่อให้เหมาะสมกับชิ้นส่วนของพืชที่จะนำมาเลี้ยง แต่ส่วนใหญ่จะมีขั้นตอนดังนี้
1.  ควรเลือกชิ้นส่วนของพืชที่จะนำมาเลี้ยงให้ปราศจากโรคและเป็นส่วนที่ยังอ่อนอยู่ ตายอดและข้อเป็นอวัยวะที่ดีที่สุด แต่ส่วนอื่น ๆ เช่น ใบ ดอก ราก ก็ใช้ได้ ที่สำคัญจะต้องไม่แก่หรืออ่อนเกินไป
 2.  ตัดเฉพาะชิ้นส่วนที่ต้องการนำมาล้างให้สะอาดด้วยผงซักฟอก
 3.  ชุบในเอทิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 – 2 นาที
 4.  แช่ต่อด้วยน้ำยาคลอร็อกซ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 – 15 นาที
 5.  แช่ต่อด้วยน้ำยาคลอร็อกซ์ 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 นาที
 6.  นำไปล้างน้ำที่นึ่งฆ่าเชื้อโรคแล้ว ประมาณ 3 ครั้ง นำเข้าตู้ปลอดเชื้อ หรือตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ เพื่อเตรียมตัดชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชลงในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อต่อไป
           การเตรียมน้ำยาฟอกฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในเนื้อเยื่อพืช น้ำยาฟอกฆ่าเชื้อนี้จะทำการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ได้เฉพาะที่ติดอยู่ที่ผิวเท่านั้น เรียกว่าทำ Surface sterilization ส่วนเชื้อจุลินทรีย์ที่อยู่ภายในเนื้อเยื่อพืช ทำให้เกิดโรคพืชนั้นยากแก่การฟอกฆ่าเชื้อ
           1.  เอทิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์ เตรียมได้จากการใช้ เอทิลแอลกอฮอล์ 95 เปอร์เซ็นต์ จำนวน 70 ml  เติมน้ำ   25  ml
          2.  คลอร็อกซ์ 10 เปอร์เซ็นต์ ได้จากการใช้น้ำ 90 ml  นึ่งในหม้อนึ่งอัดไอฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ไว้ก่อนแล้ว เมื่อจะใช้ก็เติมคลอร็อกซ์ 10 ml และสารลดแรงตึงผิว (wetting agent) เช่น Tween-20  1 – 2 หยด
           3.  คลอร็อกซ์ 5 เปอร์เซ็นต์ ได้จากการใช้น้ำ 95 ml  นึ่งในหม้อนึ่งอัดไอฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ไว้ก่อนแล้ว เมื่อจะใช้ก็เติมคลอร็อกซ์ 5 ml และสารลดแรงตึงผิว  1 – 2 หยด
           4.  น้ำ 100 มิลลิลิตร นึ่งฆ่าเชื้อไว้สำหรับล้างเอาคลอร็อกซ์ออกจากชิ้นส่วนพืชก่อนนำไปเลี้ยงบนอาหาร

3.  การนำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชลงขวด   
ขั้นตอน            1.  เตรียมทำความสะอาดตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ โดยการใช้เอทิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์ ฉีดพ่นให้ทั่วบริเวณตู้ แล้วใช้ผ้าสะอาดที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้วเช็ดให้สะอาดทั่วบริเวณ ทิ้งไว้สัก 10 นาที ก่อนใช้งาน
            2.  เตรียมเช็ดขวดอาหารที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว วางเรียงในตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ และชิ้นส่วนเนื้อเยื่อที่ฟอกฆ่าเชื้อแล้ว
            3.  ใช้ปากคีบ มีดผ่าตัดที่สะอาดโดยชุบเอทิลแอลกอฮอล์ 95 เปอร์เซ็นต์ ลนไฟ ทิ้งไว้ให้เย็น โดยวางบนจานแก้วที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว
            4.  ลนไฟบริเวณปากขวดอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อก่อนเปิดฝา
            5.  นำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อวางบนจานแก้ว ตัดชิ้นส่วนให้เล็กพอเหมาะ แล้วคีบใส่ขวดอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยอาจจะวางหรือแทงลงไปบนอาหารเล็กน้อย ลนไฟบริเวณปากขวดอีกครั้ง แล้วรีบปิดฝาขวดทันที

4.  การนำขวดเนื้อเยื่อพืชไปเลี้ยง   
                                                     
ขั้นตอน           1.  นำขวดที่จะเลี้ยงเนื้อเยื่อไปวางบนชั้นในห้องเลี้ยงเนื้อเยื่ออุณหภูมิ 25 - 28°C ความเข้มของแสง 1,000 – 2,000 ลักซ์ (หลอดไฟ 40 วัตต์ จำนวน 2 หลอด) ช่วงแสง 16 ชั่วโมงต่อวัน และช่วงมืด 8 ชั่วโมงต่อวัน
           2.  ติดตามสังเกตการณ์เจริญเติบโตของชิ้นส่วนพืช ในระยะ 3 -7 วัน สังเกตว่าชิ้นส่วนนั้นมีเชื้อราหรือแบคทีเรียขึ้นหรือไม่ ถ้ามีให้รีบนำออกจากห้องไป ถ้าขวดไหนไม่มีก็เลี้ยงต่อไป สังเกตและเปลี่ยนอาหารใหม่ทุก 2 – 4 สัปดาห์ จนได้ต้นพืชที่สมบูรณ์

5.  การย้ายเอาพืชออกจากขวดปลูกลงดิน            1.  ใช้ปากคีบหรือลวดปลายงอ ค่อย ๆ ดึงเอาต้นพืชที่แข็งแรงที่มีรากที่สมบูรณ์ออกจากขวดระวังอย่าให้ต้นช้ำ
            2.  นำไปล้างเอาวุ้นออกให้หมดด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำประปา
            3.  นำต้นพืชมาแช่ในยากันรา  นำไปปลูกในถาดเพาะชำ หรือกระถางที่มีทรายผสมขุยมะพร้าวในอัตราส่วน 1 : 1 (เก็บไว้ในที่ร่ม อย่าให้ถูกแสงโดยตรง เพราะจะทำให้ต้นสูญเสียน้ำไป ทำให้ต้นเหี่ยว)
            4.  เมื่อต้นพืชตั้งตัวแข็งแรงดีแล้ว ก็ย้ายลงปลูกในดินต่อไปสำหรับต้นกล้วยไม้ นำไปปลูกในกระถางขนาดเล็ก ใส่ถ่านและออสมันด้า เมื่อต้นมีขนาดโตแล้ว ย้ายลงกระถางขนาดใหญ่

เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อไม้ดอกไม้ประดับ

เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อไม้ดอกไม้ประดับ

อัตราค่าบริการ ต้น (plants) ชื่อสกุล (name) 1,000 2,000 3,000 5,000 10,000 ขิง (GINGER) ดาหลา (TORCH GINGER) บอนสี (CALADIUM) ออมเงิน,ทอง,นาค (SYNGONIUM) 8.00 6.50 5.50 4.50 3.50 กล้วย (BANANA) 8.00 6.50  5.50  5.00 5.50 แก้วหน้าม้า (ALOCASIA) เดหลี (SPATHIPYLLUM) สับปะรดกินหัว (ANANUS) ลิลลี่ (LILY) 9.00 7.50 6.50 5.50 5.50 ฟิโลเดนดรอน (PHILODENDRON) ซานโตโซมา (XANTHOSOMA) เปปเปอร์ (PEPEROMIA) ไม้น้ำ (ANUBIAS) กล้วยประดับ (FLOWERING BANANA) ว่านเสน่ห์จันทน์ (HOMALOMENA) 10.00 8.00 7.00 6.00 5.00 หน้าวัวดอก (CUT FLOWER ANTHURIUM) หน้าวัวใบ (CUT LEAF ANTHURIUM) สับประรดสี (BROMMELIADS) 10.00 8.50 7.50 6.00 5.00 อโกลนีมา หรือ เขียวหมื่นปี (AGLONEMA) สาวน้อยประแป้ง (DIEFFENBACHIA) เฮลิโคเนีย, ธรรมรักษา (HELICONIA) ลิ้นมังกร (SANSEVIERIA) หมากผู้หมากเมีย (CORDYLINE) ว่าน 4 ทิศ (HIPPEASTRUM) วาสนา, ช่อมรกต, เข็มสามสี (DRACAENA) คล้า  (CALATHEA) 12.00 10.00 9.00 8.00 6.00 หมายเหตุ สำหรับไม้บางประเภทที่โตช้า อาจมีการเปลี่ยนแปลงการคิดค่าบริการ ซึ่งทางบริษัทจะแจ้งให้ท่านทราบล่วงหน้า                     การคิดค่าบริการสำหรับการเพาะเมล็ดไม้ใบ ใช้อัตราเดียวกับการเพาะเมล็ดกล้วยไม้

กบนอกกะลา ตอน กล้วยไม้ไทย

มีการนำพืชเศรษฐกิจอย่างกล้วยไม้ไทยมาขยายพันธุ์พืชโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ( ตอนที่ 1) 

 

  

   

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชตระกูลขิง

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (ตอนที่ 2)

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (ตอนที่ 2)

โครงการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ฝ่ายวิชาการ สถาบันการแพทย์แผนไทย

การเตรียมอาหารเพื่อขยายพันธุ์และการเตรียม Stock Solution   "อาหารเพื่อการขยายพันธุ์"  คือ อาหารสังเคราะห์ที่เกิดจากการนำธาตุอาหารสังเคราะห์ต่างๆ มารวมกันปรับค่า pH ให้ได้ตามสูตรที่ต้องการ และเพิ่มความแข็งเพื่อการเกาะยึดด้วยวุ้น แล้วนำไปฆ่าเชื้อให้อาหารอยู่ในสภาพปลอดเชื้อ ส่วน Stock Solution คือการเตรียมสารเคมีตามสูตรในปริมาณที่เข้มข้น เพื่อความสะดวกในการนำไปใช้ Stock Solution สูตรอาหาร Murashige and Skoog.1962 (MS) สูตรเข้มข้น ปริมาณสารที่ดูดใช้ Stock 1 ความเข้มข้น 50 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml โปตัสเซียมไนเตรท (KNO3) อัมโมเนียมไนเตรท (NH2NO3) แคลเซียมคลอไรด์ (CACL2) 95.00 g 82.50 g 22.00 g 20 ml / L Stock 2 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml โปตัสเซียมไอโอไดร์ (KL) โซเดียมโมลิเดท (NA2MOO42H2O) โคบอลคลอไรด์ (C0CL26H2O)                8.30 g 2.50 g 0.25 g 0.1 ml / L Stock 3 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml มายโออินโนซิตอล (MTO-INOSITOL) บอริกแอซิค (H3BO3) โปตัสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) แมกนีเซียมซัลเฟต (MGSO47H2O) แมงกานีสซัลเฟต (MNSO4H2O) ซิงค์ซัลเฟต (ZNSO47H2O) 10.00 g 0.62 g 17.0 g 37.00 g. 2.23 g 0.86 g 10 ml/ L Stock 4 ความเข้มข้น 200 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml เอทธิลีนไดเอมีนเตตราอาซิเตต (EDTA) เฟอรัสซัลเฟต (FESO47H2O) 7.45 g 5.57 g 5 ml / L Stock 5 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml ไกลซีน (GLYCINE) นิโคตินิคแอซิด (NICOTINIC ACID) ไทอามีนไฮโดรคลอริค แอซิด (THIAMIN HCL) ไพรีดอกซีนไฮโดรคลอริค แอซิด (PYRIDOXINE.HCL) 0.20 g 0.05 g 0.01 g 0.05 g 10 ml / L Stock 6 ความเข้มข้น 100 เท่า / น้ำ (H2O) 1,000 ml คอปเปอร์ซัลเฟท (CUSO45H2O) 0.25 g 0.1 ml / L (ทำละลายใน HCL 1N)      การเตรียม Stock Solution นี้ เมื่อเตรียมเสร้จแล้วควรใส่ขวดสีชาและเก็บไว้ในที่เย็นเพื่อยืดอายุการใช้งาน การเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสูตร murashige and skoog.1926 (ms)      1. ตวงนำกลั่นใส่ภาชนะ 200 ทส      2. ตวง Stock solution 1-6 แต่ละตัวตามปริมาตรที่กำหนดใส่ภาชนะที่มีน้ำกลั่นอยู่      3. เติมน้ำตาลซูโคส 30 g      4. ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1,000 ml      5. ปรับต่อ PH ด้วย HCl 1 N หรือ NaOH 1 N ให้อยู่ในช่วง 5.6-5.8      6. ชั่งวุ้น 7 g นำไปเคี่ยวหลอมวุ้นจนเข้ากันดี      7. นำไปเทใส่ขวดขนาด 5 ออนซ์ 20 ml ขนาด 8 ออด์ 30 ml ปิดฝา      8. นำไปฆ่าเชื่อโดยใช้หม้อนึ่งความดันไอน้ำอุณหภูมิ 121 ํC เป็นเวลา 15 นาที (นับที่อุณหภูมิ 121 ํC ) ยกออกจากหม้อ ทิ้งไว้ให้เย็น ก่อนนำไปใช้ (ควรทิ้งไว้ 1 คืนก่อนนำไปใช้)      เมื่อทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อขึ้นเป็นต้นกล้าสูงพอประมาณถึงคอขวด ให้ทำการเพิ่มปริมาณต้น วิธีการปฏิบัติ      1. คัดเลือกพืชในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่สามารถนำมาเพิ่มปริมาณได้      2. ทำการแบ่งเนื้อเยื่อในขวดภายใต้สภาพปลอดเชื้อ (ทำในตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ)      3. การแบ่งเนื้อเยื่อมห้ตัดแต่งส่วนที่ไม่มีชีวิต ใบและรากบางส่วนทิ้งไป      4. ตัดแบ่งเนื้อเยื่อเป็นส่วน ๆ โดยต้นพืชในขวดที่มีการเพิ่มจำนวนด้วยการแตกหน่อ ให้ตัดแบ่งหน่อเป็นกอ ๆ ละ 2-3 ต้น      5. ต้นพืชที่มีการเจริญเป็นต้นเดี่ยว ให้ตัดแบ่งเป็นข้อ ๆ โดยแต่ละข้อให้มีตาติดอยู่      6. นำเนื้อเยื่อที่ได้ตัดแบ่งไว้วางลงบนอาหารใหม่ นำไปวางบนชั้นเลี้ยงต่อไป เมื่อต้นโตได้ขนาดแล้ว ถ้าจะทำการเพิ่มปริมาณต้นให้ทำเหมือนเดิม แต่ถ้าจะนำไปปลูก ให้นำต้นพืชนั้นไปชักนำให้เกิดราก และย้ายออกปลูกในภายหลัง  ที่มา : http://ittm.dtam.moph.go.th/data_all/articles/article28.htm

การเพาะเลี้ยงเนื่อเยื่อ( ตอนที่ 1)

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (ตอนที่ 1)

โครงการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ฝ่ายวิชาการ สถาบันการแพทย์แผนไทย

ปัจจุบันนี้ เทคโนโลยีด้านการเกษตรได้ก้าวหน้าไปอย่างมาก เป็นที่รู้จักกันมากในขณะนี้คือ การตัดต่อยีนต์ เพื่อให้สายพันธ์พืชสายใหม่ที่ทนต่อโรค แมลง และให้ผลผลิตสูง หรือรู้จักกันในนามพืช GMO ที่กำลังเป็นปัญหาถกเถียงกันในขณะนี้ว่าพืชบางอย่างได้ตัดต่อยีนต์แล้วบางตัวมีผลทำให้แมลงต่าง ๆ ตาย ซึ่งแมลงบางตัวเป็นแมลงทีมีประโยชน์ อาจส่งผลให้สภาพความสมดุลทางธรรมชาติสูญเสียไปด้วย การเพาะพันธุ์ต้นไม้ในสภาพที่ปลิดเชื้อหรือการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช (Tissue Culture) เป็นอีกวิธีหนึ่งของเทคโนโลยีด้านการเกษตรชนิดอื่นที่นอกเหนือจากพืชสวน พืชไร่ ไม้ดอก เช่นการเพาะเลี้ยงเยื่อสมุนไพร เพราะวิธีการนี้สามารถขยายพันธุ์ได้เร็วและจำนวนมาก แต่มีข้อเสียอยู่คือต้นทุนในการจัดตั้งห้องปฏิบัติการค่อนข้างสูง และขั้นตอนในการปฏิบัติการขยายพันธุ์ค่อนข้างยาก ถ้าเทียบกับการขยายพันธุ์ไม้ดอก กล้วยไม้ หรือไม้ประดับ เพราะว่าสมุนไพรในแต่ละชนิดจะมียาง ซึ่งในยางนั้นจะมีตัวยาแตกต่างกันไป และตัวยาในยางของสมุนไพรนี่เองที่มักจะทำปฏิกริยากับธาตุอาหารสังเคราะห์ที่ใช้เลี้ยงต้นพืชสมุนไพร บางครั้งอาจทำให้พืชนั้นไม่เจริญเติบโต ไม่แตกกอ ไม่ดูดสารอาหาร และจะทำให้พืชนั้นตายในที่สุด แต่ถ้าหากทดลองสูตรอาหารได้สูตรที่เหมาะสมกับพืชนั้นๆ ก็จะเจริญเติบโตได้ดี      การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คือ การนำส่วนใดส่วนหนึ่งของพืชไม่ว่าจะเป็นส่วนเนื้อเยื่อ อวัยวะต่าง ๆ ของพืช หรือเซลล์ มาเลี้ยงในสภาพที่ปลอดเชื่อจุลินทรีย์ โดยมีการควบคุมสภาพแวดล้อม เช่น อุณหภูมิ แสง ความชื้น ส่วนต่างๆ ของพืชเหล่านี้จะสามารถเจริญเติบโตพัฒนาเป็นต้นใหม่ โดยที่พืชทุกต้นจะมีลักษณะเหมือนกัน ด้วยเหตุนี้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจึงมีประโยชน์อย่างกว้างขวางในหลายสาขา เช่น ทางด้านการเกษตรทำให้สามารถขยายพันธุ์ได้จำนวนมากในเวลาอันรวดเร็ว หรือสามารถผลิตต้นพันธุ์ที่ปลอดเชื้อได้จำนวนมาก และยังสามารถสร้างพันธุ์ใหม่ ๆ ได้โดยการเพาะเลี้ยงคัพภะ (Embryo) อับละอองเกสร (Anther Culture) นอกจากนี้เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชยังมีความสำคัญ สำหรับการเก็บรักษาพันธุ์พืชในสภาพปลอดเชื้อได้ดี      การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชประกอบด้วยขั้นตอนสำคัญหลัก 6 ขั้นตอน คือ      1. การคัดเลือกเนื้อเยื่อพืช      2. การฟอกฆ่าเชื้อ      3. การเตรียมอาหารสำคัญเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ      4. การขยายพันธุ์เพิ่มจำนวน      5. การชักนำรากพืช      6. การย้ายออกปลูก      การที่จะทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชให้ได้ผลนั้น ขั้นแรกต้องฆ่าเชื้อห้องปฏิบัติการ เพราะการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชนี้เป็นการเลี้ยงในสภาพที่ปลอดเชื้อ ห้องปฏิบัติการและเครื่องมือทุกอย่างต้องปลอดเชื้อจุลินทรีย์ เพราะจุลินทรีย์เป็นศัตรูตัวฉกาจที่จะทำให้การทำงานของเรามีปัญหาที่สุด และนอกจากฆ่าเชื้อห้องและอุปกรณ์แล้วชิ้นส่วนพืชที่จะนำมาขยายพันธุ์ต้องทำการฆ่าเชื้อด้วย เรียกว่า วิธีฟอกฆ่าเชื้อ ขั้นตอนในการทำก็คือ      1. เลือกชิ้นส่วนพืชที่อยู่ในช่วงเจริญเติบโต เช่น ยอดอ่อน เมล็ด ตาข้าง ปลายราก แล้วแต่ชนิดของพืชนั้น ๆ      2. นำชิ้นส่วนนั้นมาตัดเป็นเป็นท่อนให้ส่วนข้อที่จะออกรากควรอยู่ตรงกลาง หรือถ้าเป็นเมล็ดควรทำความสะอาดแต่ถ้าเมล็ดนั้นแข็งควรนำไปแช่น้ำอุ่นสัก 1 คืน      3. เตรียมน้ำปริมาณขวดละ 90 ml นำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121  ํC เป็นเวลา 15 นาที      4. เมื่อได้น้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว ตวง Chlorox ปริมาณ 10-15 ml  หยด Tween ประมาณ 2-3 หยด ถ้าเป็นพืชที่ค่อนข้างสกปรกใส่ยาฆ่าเชื้อ (Anti biotic) ด้วย      5. นำชิ้นส่วนที่ล้างสะอาดแล้ว ใส่ลงไปในขวด แล้วเขย่าประมาณ 15 นาที      6. หลังจากเขย่าครบ 10-15 นาทีแล้ว ล้างด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้ง ครั้งละ 15 นาที แต่ควรทำภายใต้สภาพปลอดเชื้อ      7. หลังจากทำการฟอกฆ่าเชื้อแล้ว นำชิ้นส่วนลงปลูกในขวดอาหารที่เตรียมไว้      วิธีการเลือกชิ้นส่วนเนื้อเยื่อที่จะนำมาฟอกฆ่าเชื้อ      1. พืชที่เป็นเมล็ดควรเลือกเมล็ดที่มีความสมบูรณ์ที่สุด เมล็ดอ่อนหรือแก่ก็ได้      2. พืชที่ใช้ใบขยายพันธุ์ เช่น แอฟริกันไวโอเลต กลอกซีเนีย หรือกุกลายหิน ควรเลือกใบเพิ่งแตกใหม่ เพราะการปนเปื้อนน้อยและเยื่อกำลังเจริญ      3. พืชที่ใช้ยอดขยายพันธุ์ ควรเลือกยอดที่เพิ่งจะแตกตาใหม่ เพราะเป็นช่วงที่พืชพร้อมจะเจริญเป็นต้น      4. พืชที่เป็นหัว เป็นเหง้าหรือแง่ง เช่น กล่วย ขิง ดาหลา ควรเลือกที่มีตาสมบูรณ์ ถ้าเป็นกล้วยควรเลือกหน่อที่มีใบแคบหรือหน่อที่กำลังงอก      5. พืชที่ใช้คัพภะ ควรเลือกคัพภะที่แก่ ไม่ควรเลือกที่อ่อนเกินไปจะไม่งอกที่มา : http://ittm.dtam.moph.go.th/data_all/articles/article27.htm

หน่วยปฎิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คือ การนำเอาเซลล์หรือเนื้อเยื่อ หรือ อวัยวะบางส่วนของพืช เช่น ยอด       ลำต้น ใบ ราก ส่วนต่างๆ ของดอกหรือผล มาเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ ในสภาพปลอดเชื้อ   ต้นกล็อกซีเนียที่เกิดจากใบ ต้นขนุนที่เกิดจากตาข้าง ต้นประดู่ที่เกิดเมล็ด ต้นหวายที่เกิดจากเอ็มบริโอ  ส่วนประกอบของอาหารสังเคราะห์ ธาตุอาหารที่พืชต้องการ แบ่งเป็น ธาตุอาหารหลักที่พืชต้องการในปริมาณมาก เช่น ไนโตรเจน, ฟอสฟอรัส,       โปแตสเชี่ยม ฯ และธาตุอาหารรองที่พืชต้องการในปริมาณที่น้อย เช่น เหล็ก, สังกะสี, ทองแดง, โบรอน ฯลฯ วิตามิน เช่น thiamine, nicotinic acid, inositol ฯลฯ สารควบคุมการเจริญเติบโต น้ำตาล สารประกอบอินทรีย์อื่น เช่น น้ำมะพร้าว, กล้วยบด ฯลฯ วัสดุค้ำจุน เช่น วุ้น (ในกรณีที่เป็นอาหารแข็ง)  ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ประกอบด้วยส่วนสำคัญ 3 ส่วนคือ   ห้องเตรียมอาหาร ห้องย้ายเนื้อเยื่อ ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ  ขั้นตอนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เตรียมอาหารสำหรับใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ฟอกทำความสะอาดเนื้อเยื่อ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ย้ายปลูก  การเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ   ผสมสารเคมี ปรับ pH ของอาหารเป็น 5.67 - 5.70 ตักใส่ขวด 1. 2. 3. 4. นึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 เซ็ลเซียส  ความดัน  15 ปอนด์/ตารางนิ้ว นาน 15-20 นาที อาหารสำหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ......................................................................................................................................................  การฟอกทำความสะอาดชิ้นพืช  การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ  การขยายพันธุ์พืช ด้วยวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชนี้ สามารถเพิ่มปริมาณต้นพืชได้เป็นปริมาณมากในคราวเดียวกัน และใช้ระยะเวลาสั้น   เพาะเลี้ยงเพื่อกระตุ้นให้ชิ้นพืช เกิดยอดใหม่ เพาะเลี้ยงเพื่อกระตุ้นให้ชิ้นพืช จำนวนมาก เพาะเลี้ยงเพื่อกระตุ้น ให้เกิดราก เก็บรักษาเนื้อเยื่อไว้ที่ห้องที่ควบคุมอุณหภูมิ 24 0ซ, มีความเข้มแสง 2,000 ลักซ์ และให้แสงนาน 14 ชม./วัน การย้ายปลูก ย้ายปลูกและปรับสภาพต้นในวัสดุปลูกที่เป็นขี้เถ้าแกลบ และเก็บรักษาไว้ในห้องที่ควบคุมอุณหภูมิ 24 0ซ   ย้ายปลูกลงถุงดำที่มีวัสดุเพาะ ต้นขนุนจากการ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ที่มา : http://www.rspg.or.th/information/information_11-1.htm

ผลงานการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื้อกล้วยไม้

เ้อกสารประกอบการเพาะเลี้่ยงเนื้อเยื่อ

ประโยชน์และวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

เทคนิคการนำอวัยวะ เนื้อเยื่อ เซลล์หรือโพรโทพลาสต์ขอาพืชมาเลี้ยงด้วยอาหารสังเคราะห์ ในสภาพปลอดเชื้อ ภายใต้

  การควบคุมสภาพแวดล้อมได้แก่ อุณหภูมิ แสง ความชื้น และปริมาณการถ่ายเทก๊าซ

ประโยชน์ของเทคนิคการเพาะเลี้ยงพืช

ผลิตต้นพันธุ์พืชเชิงธุรกิจโดยสามารถกำหนดปริมาณและระยะเวลาได้

การผลิตพืชที่ปลอดโรคสำหรับใช้เป็นต้นพ่อ/แม่พันธุ์ในการขยายพันธุ์แบบไม่อาศัยเพศ

การคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์พืชด้วยเทคโนโลยีทางชีวภาพ

การอนุรักษ์และการเก็บรักษาพันธุ์พืชเป็นระยะเวลานานหลายสิบปี

การผลิตสารทุติยภูมิที่มีประโยชน์ในเชิงอุตสาหกรรมอาหาร ยา และ เครื่องสำอาง

การทำเมล็ดเทียมเพื่อเป็นการค้าสำหรับพืชที่มีเมล็ดพันธุ์ราคาแพง

กระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมีหลักการที่สำคัญอยู่ 3 ขั้นตอน ได้แก่

1. การคัดเลือกและการเตรียมชิ้นส่วน

2. การเพาะเลี้ยงในสภาพปลอดเชื้อ

3. การย้ายต้นพืชออกปลูกในสภาพธรรมชาติ

การคัดเลือกและการเตรียมชิ้นส่วนพืช

ชิ้นส่วนพืชที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสามารถเลือกใช้ตามความเหมาะสมกับชนิดพืชหรือวัตถุประสงค์ของการใช้งาน

การคัดเลือกชิ้นส่วนพืช

อวัยวะของพืชที่สามารถนำมาใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ เช่น

- ตายอด / ตาข้าง

- ข้อ / ปล้อง

- เมล็ด

- ใบ

- ราก

ฯลฯ

การเตรียมชิ้นส่วนพืช

ล้างทำความสะอาดและตัดแต่งชิ้นส่วนพืช

ฟอกฆ่าเชื้อด้วยสารเคมีที่ระดับความเข้มข้นและระยะเวลาที่เหมาะสม

นำลงเลี้บงบนอาหารในสภาพปลอดเชื้อ

                                         

ตัวอย่างการพัฒนาของเนื้อเยื่อพืช

การเกิดแคลลัสจากชิ้นส่วนพืช

             

การเพิ่มปริมาณต้น

          

การเกิดพัฒนาเกิดเป็นต้นที่สมบูรณ์

   

วิธีการย้ายปลูก

1. ทำการปรับสภาพ ให้ต้นไม้ได้รับแสง และอุณหภูมิธรรมชาติประมาณ 7 - 10 วัน

2. นำต้นไม้ออกจากภาชนะอย่างระมัดระวัง

3. ล้างวุ้นที่ติดรากออกให้สะอาดอย่างเบามือ

4. แช่ต้นไม้ในสารป้องกันจุลินทรีย์ ประมาณ 10 - 15 นาที

5. ปลูกในวัสดุที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้วรดน้ำพอชุ่ม

6. คลุมด้วยถุงพลาสติกเพื่อรักษาความชื้น ในสัปดาห์แรกโดยรดน้ำทุก 1 - 2 วัน

7. เมื่อครบสัปดาห์แล้วนำถุงที่คลุมออก

8. นำต้นไม้ไว้ในเรือนเพาะชำกล้าไม้

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชคืออะไร?

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คือ การนำเอาส่วนใดส่วนหนึ่งของพืช ไม่ว่าจะเป็นส่วนอวัยวะ หรือส่วนเนื้อเยื่อ มาเลี้ยงในอาหารวิทยาศาสตร์ที่ประกอบด้วย แร่ธาตุ น้ำตาล วิตามิน และสารควบคุมความเจริญเติบโต ภายใต้สภาพปลอดเชื้อจุลินทรีย์และอยู่ในสภาวะควบคุมอุณหภูมิ แสง ความชื้น โดยส่วนของพืชที่นำมาเลี้ยงนี้จะสามาถเติบโตพัฒนาได้หลายรูปแบบ ไม่ว่าจะพัฒนาเป็นส่วนอวัยวะ เกิดเป็นกลุ่มเซลล์ที่เรียกว่า แคลลัส หรือ คัพภะ (ต้นอ่อนขนาดเล็ก) ที่เรียกว่า เอ็มบริโอ ซึ่งในที่สุดก็จะสามารถบังคับให้ส่วนต่างๆ เหล่านี้เกิดเป็นต้นใหม่ที่มีรากที่สมบูรณ์สำหรับการนำไปปลูกลงดินต่อไปได้

พืชที่เกิดขึ้นมาจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะมีลักษณะเหมือนกับพืชต้นพันธุ์ที่นำมาใช้เพาะเลี้ยงทุกประการ จึงเป็นวิธีการหนึ่งที่สามารถนำมาใช้ในการขยายพันธุ์พืช และการเก็บรักษาและอนุรักษ์เชื้อพันธุ์พืชต่างๆ โดยอาศัยการเก็บกลุ่มเซลล์ที่เรียกว่า แคลลัสของพืชไว้ที่อุณหภูมิเย็นจัดถึง -196 องศาเซลเซียสภายใต้ไนโตรเจนเหลว ซึ่งวิธีนี้จะสามารถเก็บพืชได้เป็นเวลานานโดยไม่มีการกลายพันธุ์ หรืออาจใช้ในการเก็บรวบรวมพันธุ์พืชโดยบังคับให้พืชโตช้าๆ ในขวดแก้วเล็กๆ ซึ่งการอนุรักษ์พันธุ์พืชเช่นนี้จะใช้พื้นที่น้อยกว่าการเก็บพันธุ์พืชที่ผลิตเป็นต้นพืชโดยตรง

นอกจากนี้ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ยังมีประโยชน์ต่อการแลกเปลี่ยนพันธุ์พืชกับต่างประเทศที่สะดวกขึ้น พืชที่อยู่ในขวดสะอาดปราศจากเชื้อจุลินทรีย์และราที่จะทำอันตรายต่อพืช โดยเฉพาะการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสมุนไพรในรูปแบบเซลล์แขวนลอย ยังช่วยในการผลิตสารต่างๆ ที่ใช้เป็นยารักษาโรคหรือสารที่ใช้เป็นยาฆ่าแมลงได้ อีกทั้งยังเป็นประโยชน์มหาศาลในการปรับปรุงพันธุ์พืชให้พืชต้านทานโรคและแมลงได้ดีขึ้น หรือให้ผลผลิตมากขึ้น โดยอาศัยเทคนิคในการเลี้ยงต้นอ่อนขนาดเล็ก เทคนิคในการเพาะเลี้ยงอับละอองเกสรและละอองเกสรพืช หรือเทคนิคในการชักนำให้พืชกลายพันธุ์เป็นพันธุ์ใหม่ๆ โดยอาศัยสารเคมีหรือการฉายรังสี เป็นต้น

Credit สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.  "ประโยชน์จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช" หน้า 16. กรุงเทพฯ : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2542.